O Centro do Genoma Humano da USP e os 50 anos de estudo da distrofia muscular

Por Núcleo de Divulgação Científica da USP

Hoje, sabe-se que a distrofia muscular de Duchenne é causada por falhas no gene da distrofina – aquele que carrega a informação para formar a proteína distrofina. Essa proteína é responsável por manter a fibra muscular inteira. Sem ela, os pacientes com Duchenne têm fibras danificadas, que morrem rapidamente. Daí vem a degeneração progressiva da musculatura.

É possível fazer um exame no DNA para descobrir se o gene da distrofina, que fica no cromossomo X, tem defeito ou não. Aliás, a tecnologia de sequenciamento foi barateada a tal ponto que qualquer pessoa que precise (e tenha acesso) pode conhecer todo o seu genoma.

Em 1968, quando Mayana Zatz começou a pesquisar a distrofia muscular de Duchenne, nenhuma dessas informações era conhecida. Naquela época, ela era estudante de biologia no Instituto de Biociências da USP (IB). Quarenta e sete anos depois, tornou-se professora titular de genética do IB e coordenadora do Centro de Pesquisa do Genona Humano e Células-Tronco (HuG-CELL).

Nesse tempo, os avanços do conhecimento científico sobre a doença de Duchenne dependeram de pacientes, físicos, biólogos, matemáticos, químicos, médicos, engenheiros e pesquisadores com outras formações, no mundo todo.

Mayana Zatz e sua equipe fazem parte dessa lista.

Os primeiros 50 anos

A distrofia foi registrada em 1830, por Charles Bell, um cirurgião escocês. O nome veio de dys-trophen, que em grego significa “má nutrição” – de fato, os meninos com a doença perdem musculatura e podem parecer desnutridos.

Vinte e oito anos depois, o médico neurologista francês Guillaume Benjamin Amand Duchenne fez uma descrição mais completa de um menino de 9 anos que perdeu a capacidade de andar. Era um caso grave de distrofia muscular, que depois ficou conhecida como distrofia muscular de Duchenne. O médico pensava que fosse provocada por uma alteração no sistema nervoso.

O francês notou diferenças em um pedaço do músculo de um paciente vivo. Na mesma época, outro médico viu células de gordura no tecido muscular. O tecido adiposo, junto com o conjuntivo, preenche o espaço deixado pelas fibras musculares mortas.

No século 19, a biópsia passou a ser a maneira de diagnosticar as distrofias.

Edward Meryon, contemporâneo inglês de Duchenne, percebeu que a doença ocorria em membros da mesma família e afetava meninos. Descobriu-se também que a herança do problema devia vir da mãe, porque mulheres podiam ter filhos afetados de maridos diferentes. Ao olhar no microscópio tecidos de pacientes que haviam morrido, Meryon não encontrou problemas nos nervos, mas viu destruição das fibras musculares. Considerou que a distrofia era uma doença do músculo.

Os últimos 50 anos

1965: Mayana começou a graduação e logo passou a participar do atendimento a famílias com doenças genéticas oferecido pelo grupo do professor Oswaldo Frota-Pessoa, um dos pioneiros em genética no Brasil. Pouco tempo depois, uma mulher jovem procurou o serviço, já com a data de casamento marcada. Ela estava aflita porque tinha três sobrinhos com distrofia muscular e queria saber se havia chances de ela também ter filhos com a doença.

Praticamente ninguém se interessou pelo assunto. E foi a partir desse caso que Mayana iniciou suas pesquisas.

Década de 1960 e 1970: Análises probabilísticas

A causa da distrofia ainda não era conhecida, mas três informações já haviam se somado às descobertas dos primeiros 50 anos: 1. existem várias formas de distrofia muscular; 2. na distrofia de Duchenne, dois terços dos casos são herdados da mãe e o outro terço é uma novidade na família. 3. em exames de sangue de quem tem a doença, a enzina creatinoquinase (CK) está aumentada, já que ela cai na circulação sanguínea quando a célula muscular morre.

Para atender o caso da jovem, a primeira linha de investigação relacionou as duas últimas informações. Mayana começou a testar o nível de CK de todas as mulheres. Se fossem portadoras do que causa a doença nos filhos, elas talvez tivessem um pouco de degeneração muscular, ainda que compensada pela regeneração natural do músculo. Portanto, mesmo não tendo os sintomas, o nível de CK poderia estar levemente aumentado.

Aplicando esse raciocínio, foi possível distinguir algumas portadoras, enquanto outras que tinham o problema não deram nenhum sinal. O diagnóstico familiar dependia de testar todas as mulheres e fazer uma análise probabilística.

O estudo resultou em fórmulas para estimar, a partir dos dados de CK, qual era o risco de uma mãe, irmã ou tia de um menino afetado carregar o defeito.

Trabalhar com a enzima CK era a linha de pesquisa de ponta na época. O grupo de Mayana continuou nesse caminho. Buscaram outra fórmula, desta vez para classificar os tipos de distrofia muscular de uma maneira mais objetiva que apenas olhando os pacientes. Usaram os testes de CK nos homens afetados como parâmetro. Foi um trabalho com sintomas e números, porque o conhecimento sobre a doença ainda era indireto.

Outras enzimas começaram a ser relacionadas às distrofias musculares. Mayana foi à Califórnia, nos EUA, fazer o seu pós-doutorado. Na volta, começou a formar um grupo de pesquisa no IB. Entre os pacientes novos diagnosticados com Duchenne, um desenvolveu muito lentamente os sintomas da doença. Era o começo da década de 1980.

1980: Uma hipótese promissora

Os cientistas acompanharam o caso do menino, intrigados. Conforme o garoto envelheceu, não perdeu muita massa muscular. Aos 12 anos de idade, quando já deveria estar em uma cadeira de rodas, ele caminhava quase normalmente. E tinha crescido pouco, estava com a altura de uma criança de 4 anos. Andou até os 19.

A hipótese formulada foi que, como carregavam menos peso, os músculos sofriam menos estresse.

A proteção contra a distrofia muscular provavelmente vinha da falta de hormônio do crescimento.

A primeira publicação sobre o garoto foi em 1981, por Mayana Zatz, Roberto T. Betti e José Levy, no hoje extinto American Journal of Medical Genetics. Begnign duchenne muscular dystrophy in a patient with growth hormone deficiency

Depois, casos semelhantes foram descritos no mundo. A hipótese não foi provada, porque não é possível inibir o hormônio do crescimento com um remédio. A cirurgia para tirar a glândula que produz o hormônio tem muitas consequências negativas, então não foi testada. Essa perspectiva de tratamento ainda está à espera de novas conquistas científicas.

Década de 1980: O gene da distrofina

O grande salto no conhecimento sobre as distrofias musculares aconteceu no meio da década de 1980. O gene relacionado à distrofia de Duchenne e a proteína distrofina foram encontrados.

Dois artigos da revista Cell contaram as descobertas em 1987. Os autores: Louis Kunkel e Eric Hoffman, da Escola de Medicina da Universidade de Harvard, junto com outros cinco pesquisadores.

Leia os dois artigos, em inglês (disponíveis para assinantes da CellPress):

Mesmo sendo possível olhar com detalhes para o DNA, o caminho para a identificação do gene não foi simples. A busca era quase cega, porque não se sabiam quais substâncias e mecanismos provocavam a destruição das células musculares.

Os cientistas intuíam que o gene estaria no cromossomo X, já que a doença é recessiva e só afeta meninos – eles só têm um cromossomo X. As meninas, que têm 2, precisariam ter o problema genético em ambos. Como os homens com distrofia muscular de Duchenne não vivem o suficiente ou não têm condições de ter filhos, eles não passam seu cromossomo X adiante.

As pistas começaram quando foram reportados casos de garotas com distrofia muscular não relacionados aos dois genes X. Durante a formação dos óvulos que deram origem a elas, houve uma troca genética – uma translocação – entre dois cromossomos. Um cromossomo X dessas garotas foi danificado e passou a ser predominante em relação ao segundo X. Como elas tinham a doença, surgiu a hipótese de que essa translocação ocorreu afetando justamente o gene relacionado à distrofia.

A partir disso, os pesquisadores encontraram a região onde deveria estar o gene: o braço mais curto do cromossomo X. Com base nesse local, desenvolveram um exame pré-natal para fazer o diagnóstico de mães com risco de serem portadoras da mutação.

Mas o gene só foi reconhecido nas etapas seguinte, que envolveram estudos com um garoto apelidado de BB e uma pessoa com quatro cromossomos X. BB tinha quatro doenças genéticas relacionadas ao cromossomo X, portanto deveria ter um pedaço grande do cromossomo deletado. Na comparação entre o X dele e os da outra pessoa, os cientistas identificaram a região ausente no cromossomo de BB. Clonaram então essa área a partir dos cromossomos X da outra pessoa.

Outro grupo testou pacientes distróficos e percebeu que um desses clones estava faltando em boa parte deles.

Mais pesquisadores foram chamados para colaborar. Setenta e cinco cientistas de todo o mundo checaram o clone do gene em 1.300 pacientes.

Depois de várias análises, finalmente encontraram todo o gene relacionado à distrofia de Duchenne. Ele é enorme, o maior conhecido até hoje, com 2.220.391 pares de bases nitrogenadas.

1987: A proteína distrofina

Apenas 0,6% desse gene é usado para formar a proteína distrofina, que ganhou este nome por causa da doença.

Apesar de ser uma parte pequena, as informações da composição da distrofina estão espalhadas por todo o comprimento do gene. Por isso, defeitos em áreas diferentes do gene podem levar à mesma consequência – a célula muscular não produzir a proteína.

A distrofina foi caracterizada ainda em 1987. Descobriram que ela é a parte estrutural de um conjunto de proteínas que ancora a membra da fibra muscular ao citoesqueleto da célula. Assim, tem um papel importante na estabilidade da membrana e ajuda a manter íntegra a fibra muscular. Aqui surgiu a dica de por que a ausência de distrofina provoca degeneração do músculo.

Após o gene ser encontrado, mais de 60 modelos animais que não produzem distrofina foram descritos.

O camundongo MDX se tornou o mais utilizado para estudar a distrofia muscular de Duchenne.

1989: Brasil atualizado

No Brasil, as técnicas de investigação do DNA chegaram dois anos depois das publicações sobre a distrofina.

Maria Rita Passos Bueno, então orientanda de Mayana Zatz, foi ao Reino Unido fazer um pós-doutorado na Universidade de Oxford. Trouxe de volta o conhecimento para trabalhar com o genoma humano. O grupo se tornou pioneiro nesse tipo de análise no país.

Na mesma época, Mariz Vainzof fez um estágio de pós-doutoramento no Hospital for Sick Children, no Canadá. Ela aprendeu técnicas avançadas de imunohistoquímica para estudar os músculos e retornou também com os materiais para o a equipe.

Por fim, os camundongos MDX foram trazidos ao país.

Década de 90: O mundo dos genes

Na década seguinte, o caminho para descobrir os responsáveis por doenças genéticas estava aberto. Mais de 30 distrofias musculares diferentes foram definidas.

A equipe de Mayana tinha o modelo animal do camundongo MDX, mas o grande diferencial era o enorme número de pessoas diagnosticados e atendidas no serviço de aconselhamento genético. Hoje, somam-se mais de 27 mil, entre pacientes e familiares.

O grupo se aprofundou em estudar as relações entre os genes e os sintomas das doenças em seres humanos – a correlação genótipo-fenótipo. Quando identificavam uma mutação em um gene, procuravam os efeitos clínicos dessa mutação. Firmaram colaborações com Louis Kunkel, em Harvard. A equipe brasileira desvendou a ligação de 23 genes com as distrofias e outras doenças genéticas – o último artigo do tipo foi publicado neste ano.

Nessas pesquisas, notaram várias “não-correlações” entre os genes e o quadro clínico de alguns pacientes. Essa linha sobre o que protege algumas pessoas das doenças se tornou um marco do grupo.

Quanto à estrutura, financiamentos da Fapesp ajudaram a equipar o laboratório. Foi importada a primeira máquina de PCR, uma técnica de amplicação do DNA. O equipamento tratava os genes em banho maria e tinha que ser ligado à torneira para resfriar.

No fim da década de 1990, o CNPq financiou a ampliação do laboratório. Em 4 de julho de 2000, foi inaugurado o Centro de Estudos do Genoma Humano, com 1.200 m2 e equipamentos atualizados.

Anos 2000: modelo animal de cães

Mayana ajudou o processo de importação de uma cadela Golden Retriever com distrofia muscular, chamada Beth. Esse é um modelo animal clinicamente muito semelhante aos seres humanos. Beth foi enviada para a Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (USP). Dois anos depois, ela e seus filhotes foram trazidos a São Paulo.

O primeiro tratamento testado pelo Centro do Genoma nesses cães foi o uso de células-tronco para melhorar a musculatura dos animais – uma linha de pesquisa em andamento.

Enquanto isso, no mundo, cientistas focaram em encontrar técnicas para consertar o gene da distrofina, substituir a proteína ou simplesmente reparar os danos às células musculares. Alguns ensaios clínicos não tiveram sucesso; outros estão sendo aplicados. A distrofia de Duchenne continua sem cura.

Em 2003 e 2006, Ringo e Suflair, dois cachorros do modelo animal, chamaram atenção. E trouxeram uma nova perspectiva.

Eles foram diagnosticados com a distrofia muscular, mas não desenvolveram a doença. Esse novo caso de proteção contra a distrofia – agora nos animais – foi pesquisado com uso de técnicas genéticas, medição de RNA, e testes em peixes paulistinha que também não produzem distrofia (outro modelo para Duchenne).

O estudo foi conduzido por Natássia Vieira – com orientação de Mayana Zatz – e feito em parceria com Louis Kunkel (Harvard e Boston Children’s Hospital), além de colaboração de geneticistas do Broad Institute (MIT e Harvard). Os pesquisadores conseguiram relacionar mais um gene à distrofia muscular de Duchenne, desta vez em um papel compensador da doença: o gene Jagged1.

Em Ringo e Suflair – os cães que escaparam da distrofia -, esse gene produz duas vezes mais proteínas que nos cachorros com sintomas. A pesquisa foi publicada em novembro de 2015, na revista científica Cell.

Leia os artigo, em inglês (disponíveis para assinantes da CellPress):

Jagged 1 Rescues the Duchenne Muscular Dystrophy Phenotype

Década atual

A partir desse artigo, abriu-se uma via inédita para buscar tratamentos contra a distrofia muscular de Duchenne. Afinal, em vez de procurar resolver a causa da doença, pode-se agora pensar em resgatar a saúde da musculatura dos pacientes pelo mesmo mecanismo do Jagged1. Os grupos de Mayana, no Brasil, e de Kunkel, nos Estados Unidos, já investem nesse caminho.